Actividad De La Enzima Catalasa 6w4r4m

Bioquímica, Departamento de Ciencias Básicas

CINETICA ENZIMATICA

Fernando Castillo Vania Cortes Alexander Pizarro Karen Savareses Escuela de Kinesiología, Universidad Santo Tomás Docente a cargo: BQ. Rodrigo Calderón Fecha realización 03/11/2015 Fecha de entrega 12/11/2015

INTRODUCCIÓN Las enzimas son consideradas como las estructuras proteicas fundamentales para la regulación de las reacciones químicas en los distintos sistemas biológicos, que actúan como catalizadora, acelerando la reacción uniendo sus sustratos en el centro activo o catalítico, actuando disminuyendo la energía de activación aumentando la velocidad de reacción, proporcionando un ambiente específico dentro del cual una reacción determinada puede transcurrir a mayor velocidad. Debido a su alto grado de especificidad respecto a su sustrato y al gran poder catalítico que estas tienen, las enzimas son específicas para cada tipo de reacción. En la catálisis, las enzimas participan de distintas reacciones sin alterar el equilibrio de las mismas y aceleran procesos biológicos que tienden a ser muy lentos. Las enzimas requieren de la participación de otras moléculas más pequeñas como las coenzimas (biotina, NADH, entre otras) o iones metálicos llamados cofactores. Además de pequeñas coenzimas que ayudan en los procesos metabólicos, los factores que influyen el funcionamiento de las enzimas son el pH, temperatura, inhibidores/activadores, concentración de enzima y sustrato (1). De esta manera hace compatibles estas reacciones a las velocidades del organismo, de lo contrario las reacciones tardarían más de lo requerido por los organismos biológicos. Estas enzimas pueden perder su actividad catalítica si se desnaturalizan o si se disocia una enzima en sus subunidades, su actividad también se puede ver modificada por factores como la concentración de enzima o sustrato, las condiciones de pH, la temperatura y la presencia de inhibidores. Las enzimas se pueden clasificar según su función en: Oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Siendo la cinética enzimática es la principal y más antiguo método para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente. Consiste en determinar la velocidad de la reacción y el modo en que ésta se modifica en respuesta a cambios en los parámetros experimentales. Una de las enzimas con mayor importancia en el organismo es la catalasa, esta hemo proteína que se encuentra en las células del torrente sanguíneo, hígado y riñón. Posee una actividad de tipo oxidorreductadasa. La catalasa tiene la habilidad de usar peróxido de hidrógeno para oxidar toxinas, incluyendo el metanol, etanol, formaldehido y nitrito (2). Su función principal es catalizar la detoxificación de las células de un compuesto formado por el metabolismo aeróbico el peróxido de hidrogeno. Esta reacción ocurre espontáneamente dentro del organismo pero gracias a esta enzima lo realiza con una mayor velocidad de reacción, oxidándolo y descomponiéndolo a agua y oxígeno. Este compuesto es altamente reactivo el que puede provocar daño celular que proviene de la peroxidación de lípidos que conducen a la rotura de la membrana eritrocitaria y la oxidación de proteína y DNA.

OBJETIVOS Objetivos generales:  

Realizar la obtención de la enzima catalasa Observar como los distintos factores afectan e inciden en la actividad de la reacción en la enzima

Objetivos específicos:

 

Analizar el comportamiento de la catalasa con distintos factores (PH, temperatura, concentración de la enzima e inhibidor) Determinar las velocidades, porcentajes de inhibición de la enzima ya expuesta a los factores que modifican su actividad. HIPÓTESIS

El pH, la temperatura, la concentración de enzima y la presencia de un inhibidor (CN-), producen que la actividad catalítica de la enzima se vea disminuida por efecto de aquellos factores. Por ello suponemos que la catalasa reaccionará mejor a PH fisiológico que a PH extremo, disminuyendo su rendimiento. A mayor concentración de sustrato a una temperatura corporal de 37°C y el inhibidor aumentará exponencialmente. MATERIALES Y MÉTODOS Se trabajó con cuatro experiencias que fueron: efectos de la concentración de enzimas, efectos de la temperatura, efectos del pH y efectos del inhibidor HCN. Materiales:

Lanceta estéril,

Pipeta graduada, Métodos:

Pipeta Pasteur,

Bureta graduada,

Matraz Erlenmeyer,

En primer lugar se debe enfriar 20 ml agua destilada en un tubo de ensayo. Para obtener la catalasa se debe hacer una pequeña punción con una lanceta esterilizada en el dedo índice, la primera gota se deshecha y posteriormente (aprox 0.5ml) se recolecta el resto en la pipeta Pasteur en el tubo de ensayo con agua destilada fría. 1. Efecto de la concentración de enzima. Se procede a enumerar los matraces de Erlenmeyer del 1 al 5, se les agregaron 5mL de H2O2 a cada uno, el n°1 fue el matraz de control por lo tanto no llevo enzima. A los demás (2-5) se le agregó 0.1; 0.2; 0.3; 0.4 mL respectivamente de la preparación de enzima obtenida de la sangre. Luego de un minuto de haber agregado la enzima se adicionan 5 mL de H2SO4 2M para detener la reacción enzimática. Al finalizar esto, se titularon los matraces con KMnO4 0,05M y se concluyó la experiencia. 2. Efecto de la temperatura. En esta experiencia se necesitó de 8 matraces de Erlenmeyer los cuales se enumeraron en series de dos (A-B), en cada uno se colocó 5mL de sustrato H 2O2, todos los matraces poseen enzima, siendo la serie “A” los controles, luego se expusieron a diferentes casos; Serie 1: a 6°C (en hielo), Serie 2: Temperatura ambiente de 15°C, Serie 3: a 36°C, Serie 4: a 50°C.vPosterior a esto a la serie “B” se le agregó 0.5mL sin ser expuesto al medio, al haber pasado un minuto de haber agregado la enzima se adiciona 5 mL H2SO4 2M. Los matraces van a ser retirados de la temperatura en la que se encuentran y serán titularlos con solución KMnO 4 0,05 M. 3. Efectos del pH. En el caso del pH se utilizó 10 matraces de Erlenmeyer, fueron enumerados en par del 1 al 5 (A-B), se puso en cada uno 5mL de H2O2 0,24%, con diferentes pH: Serie 1: pH 3, Serie 2: pH 5, Serie 3: pH 7, Serie 4: pH 9, Serie 5: pH 11 Los matraz “A” fueron los de control por lo tanto lo llevaron enzima y se les agregó 5 mL de H2SO4 2 M. A los matraces “B” 0,5 mL del sustrato (catalasa), un minuto después exactamente se le agregó 5 mL de H 2SO4 2 M para detener la reacción enzimática, finalmente los matraces se titularon con KMnO 4. 4. Efecto del inhibidor KCN. En este caso fueron enumerados 5 matraces de Erlenmeyer, siendo; Matraz n°1: Control. Matraz n°2: Control sin inhibidor. Matraz n°3, 4, 5: llevaron concentraciones crecientes del inhibidor (KCN 0,0001M, 0,001M y 0,01M respectivamente). Al matraz n°1 se le adicionó inmediatamente 5 mL de H2SO4 2M, y a los matraces 2,3 ,4 y 5 se les agregó 0,5 mL de enzima, luego se detiene la reacción al minuto con 5 mL de H 2SO4 2M. Finalmente se titulan los matraz con solución KMnO4 0,05 M.

Para hacer el cálculo de las velocidades tenemos los mL de todos los matraces y tenemos los moles remanentes del primer matraz que eran 350, se hace una regla de tres simples, donde los 350 moles van a equivaler a los primeros mL gastados y los mL gastados del segundo matraz van a equivaler a los moles remanentes del segundo matraz, y ahí nos da moles remanentes y con eso se puede sacar la velocidad restándole los moles iniciales menos los moles remanentes de cada matraz y con eso se obtiene la velocidad. Para calcular el porcentaje de inhibición se saca primero la velocidad igual que en el paso anterior, el primer valor de velocidad equivale al 100% de actividad enzimática, por lo que el segundo valor de velocidad equivale a el valor de actividad del segundo matraz y para sacar el porcentaje de inhibición se resta a 100 el porcentaje de actividad que daba como resultado de la regla de tres simples. RESULTADOS

Efecto de concetracion

Como muestra la figura número 1, a medida que aumenta la concentración de sustrato, la velocidad enzimática aumenta hasta llegar a su Vmax.

Figura número 1, efecto de la concentración obtenidos en el práctico.

Tabla de datos de concentración N°

mL de H2O2 pH 7 0,24%

1

5

µmoles iniciales de H2 O 2 350

mL de enzima

mL de H2SO4 2N

0

5

mL de KMnO4 gastados

12,5

µmoles de H2 O 2 remanentes 350

µmoles de H2O2 que reacciono XXX

Velocidad (µmoles H2O2/min) XXX

2 3 4 5

5 5 5 5

350 350 350 350

0,1 0,2 0,4 0,5

5 5 5 5

11,4 10,6 8,95 7,95

319,2 296,8 250,6 222,6

Figura número 2, efecto de la temperatura obtenidos de los resultados en el práctico.

30,8 53,2 99,4 127,4

30,8 53,2 99,4 127,4

Figura número 3, efecto de la temperatura optima según Lehninger.

Efecto temperatura

Tabla de datos de temperatura N°

mL de H2O2 pH 7 0,24%

1ª 1B 2ª

5 5 5

µmoles iniciales de H2O2 350 350 350

mL de enzima

mL de H2SO4 2N

0 0,5 0

5 5 5

mL de KMnO4 gastados 14 9,3 13,633

µmoles de H2 O 2 remanentes 350 232,5 350

µmoles de H2O2 que reacciono XXX 117,5 XXX

Velocidad (µmoles H2O2/min) XXX 117,5 XXX

2B 3A 3B 4A 4B

5 5 5 5 5

350 350 350 350 350

0,5 0 0,5 0 0,5

5 5 5 5 5

7,85 12,833 7,4 13,2 9

201,533045 350 201,823424 350 238,636364

148,466955 XXX 148,176576 XXX 111,363636

148,466955 XXX 148,176576 XXX 111,363636

“El pH óptimo o intervalo de pH de cada enzima es diferente y cuando varía, la conformación de la enzima se altera, produciéndose un cambio en el estado de ionización de grupos del sitio activo y llegando a no ser funciona

Efecto de pH

” (4) (Lehninger, 2006)

Tabla de datos de pH N° 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4ª 4B 5ª 5B

mL de H2O2 pH 7 0,24% 5.- pH=3 5.- pH=3 5.- pH=5 5.- pH=5 5.- pH=7 5.- pH=7 5.- pH=9 5.- pH=9 5.- pH=11 5.- pH=11

µmoles iniciales de H2O2 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350

mL de enzima

mL de H2SO4 2N

0 0,5 0 0,5 0 0,5 0 0,5 0 0,5

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

mL de KMnO4 gastados 13,1 12,1 11 7,23 13 8,5 11,73 7,5 0,9 0,6

µmoles de H2 O 2 remanentes 350 323,2824427 350 230,0454545 350 228,8461538 350 223,7851662 350 233,3333333

µmoles de H2O2 que reacciono XXX 26,7175573 XXX 119,954545 XXX 121,153846 XXX 126,214834 XXX 116,666667

Velocidad (µmoles H2O2/min) XXX 26,7175573 XXX 119,954545 XXX 121,153846 XXX 126,214834 XXX 116,666667

Al aumentar la concentración de inhibidor la velocidad disminuye alcanzando su punto de inhibidor competitivo.

Efecto Inhibidor

Tabla de datos de inhibidor N°

mL de KCN 0,0001 M -

mL de KCN 0,001 M

mL de KCN 0,01 M

mL de enzima

mL de H2SO4 2N

1 2

mL de H2 O 2 0,24% pH=7 5 5

mL de KMnO4 gastado s

µmoles H2 O 2 remanente

Velocidad (µmoles H2O2/min)

% de inhibición

-

-

0 0,5

5 5

13,45 7,05

5

9,55

-

0,5

5

12

XXX 166,54275 1 101,48698 9 37,732342

XXX 0%

0,5

350 183,45724 9 248,513011

3

5

0,5

-

-

4

5

-

0,5

5

5

-

-

0,5

0,5

5

12,75

312,26765 8 331,78438 7

18,215613 4

DISCUSIÓN Las enzimas tienden a funcionar dependiendo el medio en el que se encuentren, además del tipo de reacción que deban catalizar. La concentración de sustrato, se determinó que mientras más alta sea la concentración de esta, la velocidad de reacción será mayor y la enzima funcionará de manera más efectiva, pero a medida que la concentración de sustrato sea mayor, la enzima tardará más tiempo en reaccionar, ya que al haber una mayor cantidad de sustrato, tiene que tener

39,07% 77,34% 89,06%

una mayor capacidad de catalizar esta, el punto máximo a alcanzar seria en teoría su Vmax en donde el sitio activo estaría completo con sustrato. En el caso de la catalasa, al ser una enzima presente en la sangre, se pensaría que su pH óptimo alcanzaría un rango de 7, pero la realidad es que su pH óptimo estaría rodeando los 7 a 9, no obstante, en los valores de ph restantes la actividad disminuyo siendo 3 y 11 en donde la curva cayo totalmente, que fue en donde la la enzima perdió su estructura 3D, , la velocidad de reacción que se halló a pH 7 fue de 119,954545 umolesH2O2/min; Dando así a conocer que nuestra hipótesis era Correcta, y la actividad enzimática de la catalasa es más efectiva a pH fisiológico, La estabilidad que presenta el peróxido frente a pH 11 se debe que las soluciones sin contaminar de peróxido de hidrógeno, son lo más estables a pH ligeramente más ácido que el valor de pH natural 7 según Slater: ”Estudió los datos relativos a la velocidad de descomposición de la solución de peróxido de hidrógeno al 3%, viendo que aumentaba cuando se la volvía más alcalina con hidróxido sódico, si bien luego mostró cómo este efecto disminuía considerablemente si se le añadía de forma similar silicato sódico. Este comportamiento se explica debido a la acción estabilizante del silicato, probablemente ejercida frente al agente catalítico responsable de dicho aumento de descomposición” (4)(E. Trabal 2004).

En cuanto a los resultados obtenidos en los porcentajes de inhibición están acorde a nuestros conocimientos y referencias. Al aumentar la concentración de inhibidores es correcto que aumente el porcentaje de inhibición de la enzima. Esto se explica en el caso de la enzima catalasa y su inhibidor el KCN porque el CN actúa como inhibidor competitivo uniéndose al hierro presente en los grupos hemo de esta hemoproteÍna inhibiéndola así de forma competitiva en su sitio activo, hasta alcanzar su la saturación del mismo. Un dato importante a discutir es donde los resultados obtenidos en el practico sobre la actividad del efecto de la temperatura en donde el grafico representado (Fig. 2) no presenta datos posibles a discutir según la literatura, según a nuestro criterio esto se debe a la calidad de los reactivos y el mal manejo de los procedimientos en laboratorio lo que conllevaría a tal error, pero según la literatura podemos emplear el grafico de acción de una literatura (Fig3) en donde según Lenhinger esto se explica “Cada enzima tiene una temperatura óptima de actuación. Por debajo y por encima de esta temperatura, la enzima ralentiza la velocidad de la reacción enzimática. Se observa que muchas de las enzimas, duplican la velocidad de una reacción enzimática cuando se aumenta la temperatura de unos 10° C aproximadamente y luego cae muy rápidamente por encima de los 40° C” (3) (Lehninger, 2006)

CONCLUSIÓN La actividad catalítica es bastante compleja y se pudo evidenciar en la experiencia que fue realizada en el laboratorio, donde las variaciones de las condiciones óptimas van a influir de manera significativa en los resultados de su desempeño catalítico.

Cabe destacar el importante rol que cumple la catalasa y lo indispensable que son las enzimas a nivel biológico, ya que existen mínimas condiciones que van a cambiar su acción como el pH, temperatura, concentración de enzimas e inhibición enzimática, éstas producen un efecto llamado velocidad catalítica la cual va a aumentar, disminuir o mantenerse la actividad catalítica dependiendo del factor que se está modificando. CUESTIONARIO 1. ¿Por qué se puede obtener catalasa al agregar sangre sobre agua destilada? La catalasa se encuentra dentro de los eritrocitos, al someter una pequeña muestra de sangre sobre agua destilada, estos glóbulos rojos producen hemolisis debido a la diferencia de las concentraciones intra y extra celulares en un medio hipotónico lo que produce la liberación de la enzima catalasa en el medio, es decir, las células al exponerse al agua destilada “explotan” y liberan su contenido celular al medio. 2. ¿Cuál es la importancia de la presencia de catalasa en las células? La catalasa es la enzima responsable de la descomposición del peróxido de hidrógeno, el cual es un compuesto tóxico (en oxígeno y agua). Catalasa participa en la protección y mantenimiento del balance oxidante/antioxidante del metabolismo celular. Descompone el peróxido de hidrógeno y H 2O2, obteniendo agua. Debido a que el peróxido de hidrogeno es fuertemente oxidante. Por esta razón la sangre y el hígado de los mamíferos contienen la enzima catalasa que cataliza la descomposición de compuestos oxidantes. 3. ¿Qué pasaría si no hubiera catalasa presente en las células? Investigue si existen condiciones asociadas a una deficiencia de catalasa La catalasa tiene un efecto antioxidante, por lo cual disminuye los radicales libres y la deficiencia de esta, se denomina Acatalasia o acatalasemia. Por lo cual, cuando se presenta la Acatalasia se caracteriza por la ausencia de actividad de la catalasa en los eritrocitos, lo cual está asociado con las lesiones orales ulcerantes/gangrenosas, pudiendo producir la pérdida de dientes y graves destrucciones de los maxilares y regiones blandas que los cubren. 4. ¿Cuál es el efecto que tiene el cianuro (CN) en la actividad de la catalasa? ¿En qué se fundamente esta acción? El cianuro corresponde a un inhibidor competitivo de la catalasa. Este inhibidor se une a él Fe+2 presentes en la molécula de la catalasa, lo que causa la inhibición completa de esta es decir, la actividad enzimática se bloquea por completo desde su sitio activo. Por consecuencia impide la actividad enzimática. Además, el cianuro inhibe la cadena transportadora de electrones en la mitocondria, ya que al unirse al citocromo A3, bloque el metabolismo aeróbico de ella que lo lleva finalmente a la asfixia.

BIBLIOGRAFÍA (1) Principios de Bioquímica, Lehninger, 2005. (2) Bioquímica. Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida, Werner MüllerEsterl (3) LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega, Barcelona, 2006, p. 212. (4) E, T. (2004). upcommons. Obtenido de http://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099/6041/Article03.pdf?sequence=1