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ESPECTROFOTOMETRÍA

El fotómetro es un aparato que tiene la capacidad de medir la concentración de una solución coloreada. Se fundamenta en el hecho de que la luz blanca (compuesta por todos los colores del espectro visible) al atravesar una solución transparente o no coloreada, ej el agua, es absorbida en muy pequeña cantidad pero casi todas es transmitida a traves del líquido. Si esta luz incide sobre una célula fotoeléctrica conectada a un instrumento registrador puede medirse la cantidad de luz transmitida en porcentaje, es decir, casi 100% y la absorbida será casi 0%. Si la solución es coloreada, la luz blanca al atravesarla sufre una determinada absorción y el resto se transmite; pero esta absorción todavía es escasa, porque solo representa una fracción pequeña de la luz total, por lo tanto el instrumento registrador indicará una escasa variación. Debe considerrarse que una solución coloreada absorbe rayos luminosos de determinada longitud de onda, entonces pueden utilizarse sólos rayos lumnosos que se absoprben especificamente; por lo tanto la cantidad de esta luz absorbida por la solución coloreada es mayor y existe una mejor sensibilidad para medir pequeñas diferencias en la intensidad de color. Para obtener rayos luminosos de determinada longitud de onda se pueden utilizar: - Filtros, que seleccionan un determinado grupo de longitudes de onda, eliminando otras. - Espectroscopio: es un prisma o una rejilla de difracción que descompone la luz blanca en un espectro, del cual se puede seleccionar solo una longitud de onda necesaria. Por lo tanto existen dos tipos de fotómetros: el de filtro y el monocromador o espectrofotómetro. FOTÓMETRO DE FILTRO Consiste de las siguientes partes: a) Fuente de luz: generalmente una lámpara de tungsteno b) Los filtros: son cristales coloreados intercambiables, que seleccionan un grupo de longitud de onda, usualmente pueden bastar tres colores:azul (430-475

µm de longitu de onda), verde (505-555 µm ) y rojo ( 620-700 µm ), la elección del color se ha establecido experimentalmente con soluciones patrones, para observar cual de los filtros favorece una mayor absorción y así obtener la máxima sensibilidad en la lectura del aparato. Ejemplo asi tenemos que las soluciones azules absorben fuertemente el rojo, por lo tanto deben de elegirse el filtro rojo, pero a veces se utilizan filtros que no son de màxima absorción para minimizar la interferencia de otras sustancias. c) Cubeta: es el tubo donde se coloca la solución coloreada motivo del examen, está especialmente calibrado para usarse con un determinado fotómetro. d) Detectores fotosensibles: son sistemas que convierten las ondas luminosas que llegan después de atravesar la cubeta, en corriente eléctrica (voltaje). e) Medidor: es el sistema que registra la energía eléctrica, generalmente es un galvanómetro, donde se realizan las lecturas en una escala graduada. FOTÓMETRO MONOCROMADOR (ESPECTROFOTÓMETRO) Las partes de este aparato son esencialmente semejantes al fotómetro de filtro, solo que a diferencia de ésta utiliza un espectroscopio, bajo la forma de una rejilla de difracción o un prisma para obtener luz monócroma de una sola longitud de onda. El medidor, presenta una doble escala paralela, transmitancia de 0-100% y absorbancia de 0 a 2. En la actualidad son los aparatos más utilizados por su exactitud y versatilidad. MANEJO DEL ESPECTROFOTÓMETRO a) Prender el aparato y esperar que caliente. b) Llevar el aparato a 0 de absorbancia 0 100% de transmitancia, utilizando como “blanco” una cubeta con agua destilada o con reactivo solo. c) Depositar en otra cubeta la solución problema y colocar en lugar de la cubeta “blanco”. d) Observar el desplazamiento de la aguja indicadora del medidor y anotar la absorbancia o transmitancia señalada. LEY DE BEER (LAMBERT) Establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida. Luego, no existe una proporción aritmética simple entre la absorción de la luz y la concentración de la solución coloreada, sino una relación logarítmica que se expresa en las escalas de los fotómetros, así tenemos: a)Escala de Transmitancia: que se halla dividido en 100 partes iguales, del 0 al 100%. b) Escala de absorbancia: son divisiones desiguales espaciadas logaritmicamente. FACTOR DE CALIBRACIÓN

Si consideramos que la absorción de una solución coloreada es directamente proporcional a su concentración siempre que el desarrollo de la coloración siga la Ley de Beer, entonces tendremos que dos soluciones, una de concentración conocida ( patrón) y otra desconocida (problema), procesadas y leídas identicamente guardan una relación entre sus absorbancias y concentraciones que permite calcular la concentración desconocida. C1 = Concentración conocida ( solución patrón) A1 = Absorción de solución conocida C2 = Concentración de solución desconocida (solución problema) A2 = Absorción de la solución desconocida Ecuación:

1)

A1/A2 = C1/C2 , en donde:

2) C2 = (A2 ) (C1) / A1 Cuando los aparatos utilizados solo expresan transmitancia pueden emplearse tablas para conversión a absorbancia. De la ecuación 2) notamos que la expresión C1/A1 (perteneciente a la solución patrón) siempre se repetirá si el método tiene una capacidad de reproducción exacta, pudiéndose expresar como número entero o decimal, denominándose factor de calibración. Finalmente la concentración Desconocida C2 = A2 (absorbancia de la solución desconocida) x Factor. Es conveniente en lo posible calcular el factor diariamente para cada serie de exámenes o cada vez que se preparan nuevos reactivos. CURVA PATRÓN Se preparan 4-6 soluciones patrones de diferentes concentraciones que deben variar entre los límites que suelen observarse en la práctica. procesar estas soluciones de acuerdo al método utilizado tomándose precauciones con las diluciones y correcciones necesarias, de tal forma que sean idénticas a las determinaciones de las muestras de pacientes. Las lecturas se registran en Tramitancia o en Absorbancia. Graficar las lecturas de Transmitancia en papel semilogarítmico, señalando la concentración de las sustancias en el eje de abscisas que tiene divisiones aritméticas (iguales) y la transmitancia en el eje de las ordenadas que tienen divisiones que tienen divisiones logarítmicas (desiguales). Si se grafican las lecturas de absorbancia se utiliza papel milimetrado (divisiones iguales), colocando indistintamente en un eje las cifras de absorbancia y en el otro las concentraciones de la sustancia. Las curvas deben de ser preparadas para cada aparato en el propio laboratorio. Si se realizan cambios en el aparato o se preparan nuevos reactivos debe de hacerse una nueva curva.