Bases Inmunologicas De Las Vacunas 5p6l4z

CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ BASES INMUNOLOGICAS DE LAS VACUNAS Dr Miguel F Galicchio Inmunología Pediátrica Hospital de Niños “Victor J. Vilela”. Rosario

Objetivos: • • • • • • •

Repasar e introducir algunos conceptos de inmunología básica. Reconocer las formas de activación del sistema inmune. Conocer las características de los diferentes antígenos vaccinales y sus propiedades. Conocer las propiedades de los antígenos conjugados. Conocer las características de la respuesta efectora contra los antígenos vaccinales (anticuerpos y linfocitos) Saber reconocer adecuadamente las características de respuesta primaria y secundaria de anticuerpos. Recordar los requisitos principales de una vacuna.

Contenido:

Nuestro organismo está sometido a agresiones múltiples de parásitos, bacterias (extracelulares e intracelulares) y virus. Entonces, es importante, que el sistema inmune sepa clasificar estos agresores y armar una respuesta efectora capaz de eliminarlos. • En el caso de las bacterias extracelulares y de sus productos tóxicos, la respuesta eficaz consiste en la producción de anticuerpos opsonizantes o neutralizantes. • Si se trata de bacterias intracelulares que se replican en el interior de los fagosomas, la respuesta más contundente corre a cargo de los linfocitos T, que activan los fagocitos en un proceso inflamatorio de hipersensibilidad retardada. • Si nos hallamos frente a una infección vírica, aunque los anticuerpos pueden limitar la difusión del virus a otras células, sólo una respuesta citotóxica acabará con las células infectadas y eliminará el virus. Estos 3 tipos de respuesta (anticuerpos, inflamación y citotoxicidad) son los mecanismos efectores del sistema inmunitario. Para que se activen las células B productoras de anticuerpos, deben procesar el antígeno y exponer en la membrana fragmentos del mismo asociado con una estructura proteica específica, el complejo mayor de histocompatibilidad clase II. El compuesto constituido por antígeno y MHC de clase II lo reconocen luego las células T coadyuvantes que, a su vez, producen citoquinas; éstas estimulan la proliferación de las células B y la secreción de anticuerpos. Bases inmunológicas de las vacunas - Dr. Miguel F. Galicchio

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ Por su parte, se produce la respuesta de los linfocitos T citotóxicos cuando las proteínas antigénicas se originan en el interior de las células. Acontece así con los patógenos intracelulares, como los virus. En este caso, los antígenos sintetizados en el interior celular, tras su degradación, aparecen en la superficie de las células en asociación con los componentes del MHC de clase I. Las células precursoras de los linfocitos citotóxicos reconocen luego los complejos antígenoMHC de clase I y maduran transformándose en células asesinas que eliminan selectivamente las células infectadas por el patógeno. Después de eliminar al agente invasor, nuestro sistema inmunitario "guarda memoria de este o", para que nuestro organismo lo reconozca en adelante y evite cualquier ataque del agente infeccioso. Los principales representantes de la memoria inmunitaria son los clones de células T; pueden sobrevivir durante largos períodos, incluso la vida entera de un individuo. A través de la producción de citoquinas, los clones facilitan la activación de las células B productoras de anticuerpos y de las células T citotóxicas precursoras, cuando vuelvan a encontrarse con el microorganismo de su especificidad.

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ LOS PRINCIPALES MECANISMOS EFECTORES del sistema inmunitario son tres: producción de anticuerpos, inflamación y citotoxicidad. El antígeno pasa al interior de una célula presentadora de antígenos; ésta expone, en su superficie, fragmentos del mismo asociados con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II. Entonces, células T inactivas reconocen el complejo constituido por antígeno y MHC y se multiplican en consecuencia. Las células T activadas median los tres mecanismos efectores a través de la producción de citoquinas específicas. El principio de la vacunación se nos ofrece entonces en su máxima expresión. A través de la vacuna quedamos expuestos a un "material biológico" que imita al agente infeccioso. Por eso, el sistema inmunitario desencadena la resistencia ante el patógeno y lo memoriza, sin experimentar la infección ni la enfermedad. El proceso viene a ser como introducir en el organismo un "chip" de memoria con determinadas instrucciones. Para vacunar contra un patógeno, se inocula en el organismo un microorganismo muerto (vacunas muertas), un microorganismo vivo pero incapacitado para desencadenar la enfermedad (vacunas vivas atenuadas) o una porción purificada del patógeno (vacunas de subunidades).

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LAS CELULAS T ayudan a las células B a producir anticuerpos. La unión del antígeno a inmunoglobulinas de superficie sirve de señal de las células B; al mismo tiempo, el antígeno pasa al interior de las células presentadoras de antígeno, que lo degradan en péptidos y estos se asocian con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II y activan a las células T coadyuvantes inactivas. El antígeno ligado y las señales de las células T coadyuvantes activadas provocan que las células B comiencen a multiplicarse y a diferenciarse en células plasmáticas secretoras de anticuerpos Las vacunas son generalmente utilizadas como una forma de inmunoprofiláxis, de tal manera que confieran protección aún mucho tiempo antes de la exposición al agente infeccioso. El sistema inmunológico específico o adaptativo, con sus linfocitos B y T, es el responsable de generar la inmunidad duradera que sigue a una infección natural o a las inmunizaciones.

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ La respuesta inmune depende de la estructura antigénica del microorganismo o la de sus productos químicos (toxinas). Luego de la exposición al antígeno, las células B y T proliferan en clones y producen anticuerpos y células efectoras específicas. INMUNOGENOS Y ANTIGENOS: Cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmune específica cuando es introducida dentro del organismo es un inmunógeno, por lo tanto, inmunogenicidad es la capacidad de una sustancia de inducir una respuesta inmune detectable. Los antígenos son sustancias capaces de ser reconocidas por los linfocitos T y B y de unirse a los receptores específicos de su superficie y en consecuencia, de ser objeto de una respuesta inmune específica. Antigenicidad es la capacidad de un antígeno de ser reconocido y unirse a un receptor de células T o B específicos. Como es lógico en vacunas, los antígenos de interés son los de los microorganismos patógenos que, además, son inmunógenos, es decir los antígenos inmunizantes y en concreto los que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora de la infección clínica en cuestión. Factores determinantes de la inmunogenicidad: a- Naturaleza fisicoquímica de la sustancia: Para ser inmunógena, una sustancia debe ser extraña al organismo que se ha de inmunizar, de elevado peso molecular, poseer cierta complejidad química y ser biodegradable una vez introducida en el organismo. Sólo las moléculas extrañas al huésped inmunizado tienen capacidad inmunógena en dicho individuo. Cuanto más extraña es una sustancia, mayor es la respuesta inmunitaria que desencadena, es decir, cuanto más extraño es el antígeno, más inmunógeno. Cuanto mayor es el peso molecular de una sustancia, mayor es su inmunogenicidad. Para ser inmunógena debe poseer cierta complejidad química y ser a la vez estable, para poder alcanzar el lugar de interacción con las células del sistema inmune y biodegradable o sea ser susceptibles a degradación enzimática como se produce durante el procesamiento del antígeno por la célula presentadora de antígeno. b- Características genéticas del huésped: La habilidad de producir una respuesta inmune determinada es hereditaria. Si el huésped no posee los genes necesarios para la respuesta inmune frente a un inmunógeno determinado, esta no se producirá aunque la sustancia reúna todas las características mencionas antes, que le confieren potencial inmunógeno. Bases inmunológicas de las vacunas - Dr. Miguel F. Galicchio

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c- Dosis y vía de entrada del inmunógeno: Inmunogenicidad icrementada Dosis

intermedia

Vía

Inmunogenicidad disminuída elevada o baja

subcutánea > intraperitoneal > intravenosa o intragástrica

Forma

Adyuvantes

particulada

soluble

desnaturalizada

nativa

liberación lenta

liberación rápida

Antígenos inmunizantes: No todas las moléculas que contienen los microorganismos patógenos son inmunógenas y/o antigénicas. En los virus, por ejemplo, sólo algunos componentes proteicos de la cubierta o del núcleo son capaces de desencadenar respuesta inmune y ser reconocidos de forma específica por anticuerpos y receptores de linfocitos T. El antígeno inmunizante puede ser una sustancia soluble producida por un microorganismo (toxoide) o una sustancia presente en el microorganismo, especialmente en su superficie. La mayoría de los antígenos inmunizantes utilizados en vacunación son proteínas o polisacáridos capsulares. Antígenos T- dependientes y T- independientes: Hay 2 tipos de antígenos inmunizantes: los T- dependientes que requieren del estímulo de las células Th2 para iniciar la producción de anticuerpos y los Tindependientes, que no la necesitan. T- dependientes • • • •

La mayoría son antígenos proteicos Son inmunógenos en menores de 2 años de vida Respuesta de anticuerpos de tipo IgG Dejan memoria inmunológica

T- independientes • • •

La mayoría son antígenos polisacáridos, lipopolisacáridos, etc Poco inmunógenos en menores de 2 años de vida Respuesta de anticuerpos de tipo IgM

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No originan memoria inmunológica

Para permitir que los antígenos T-independientes puedan cumplir con las características de los T- dependientes o sea, ser inmunógenos en menores de 2 años de vida, producir respuesta tipo IgG y por lo tanto generar memoria inmunológica de larga duración, hay que conjugarlos con un transportador proteico (carrier) como el toxoide tetánico y diftético (es el caso de la vacuna triple bacteriana conjugada con el componente H influenzae tipo b) o a otras proteínas (ej: vacuna antineumococo heptavalente).

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ PARA OBTENER UNA RESPUESTA de anticuerpos óptima a una estructura de carbohidratos (PLS) que no acostumbra ser inmunogénica para las células T, se une covalentemente al carbohidrato una proteína portadora. El glucoconjugado es procesado por las A, que presentan los epítopos de la proteína portadora a las células T coadyuvantes. Estas células T activadas ayudarán a las células B que han sido señaladas por la unión del carbohidrato e inmunoglobulinas específicas expuestas en la superficie. A: célula procesadora de antígeno PLS: polisacárido

MECANISMOS EFECTORES. ELIMINACION DEL ANTIGENO: Anticuerpos: Los anticuerpos pueden participar en la defensa del huésped contra la infección y en la eliminación de los agentes patógenos mediante 5 mecanismos principales: a- Neutralización de toxinas bacterianas: La forma más simple que utilizan los anticuerpos para protegernos de los microorganismos y sus productos es fijándose a ellos y por lo tanto bloqueando su a las células a destruir (toxinas) o a infectar (virus). Este es el mecanismo protector frente al tétanos y a la difteria. b- Neutralización de virus: Los anticuerpos también pueden neutralizar partículas víricas completas, así impiden su entrada a la célula y su posterior replicación. Una vez que el virus penetró en la célula diana, la neutralización es menos importante y el papel principal para la eliminación de la infección lo tienen los linfocitos T citotóxicos. c- Opsonización- activación de los fagocitos: La fijación por los anticuerpos no es suficiente por sí sola para impedir la replicación de las bacterias que se multiplican fuera de las células. En este caso el papel de los anticuerpos que cubren las bacterias es facilitar el reconocimiento como producto extraño por los fagocitos, los cuales las ingieren y destruyen (opsonización). d- Activación del complemento: Su principal función, al igual que la de los anticuerpos, es facilitar a los fagocitos la ingestión y destrucción de las bacterias. e- Lisis por células NK (natural killer): Bases inmunológicas de las vacunas - Dr. Miguel F. Galicchio

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ Los anticuerpos IgG se unen a los receptores Fc de la superficie de las células NK y las preparan para realizar una lisis celular específica de antígeno denominada citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Linfocitos: Algunas bacterias , parásitos y todos los virus se replican en el interior de las células, donde no llegan los anticuerpos. En este caso, la destrucción de los antígenos está a cargo de los linfocitos T citotóxicos. a- Citotoxicidad por linfocitos T citotóxicos: Son fundamentales en el control de infecciones víricas, como es el caso de las vacunas a gérmenes vivos atenuados. b- Activación de macrófagos infectados por bacterias por las células Th1: Algunas bacterias intracelulares (ej: M tuberculosis) sobreviven porque las vesículas que ocupan dentro del macrófago no se fusiona con los lisosomas. Estas infecciones pueden ser controladas por los linfocitos Th1, los cuales activan al macrófago induciendo la fusión de los lisosomas con las vesículas. CINETICA DE LA RESPUESTA INMUNE: RESPUESTA PRIMARIA Y SECUNDARIA. La primera exposición de un individuo a un antígeno vaccinal, se denomina inmunización primaria. La respuesta inmunitaria que se produce (relativamente débil y de corta duración) es la respuesta primaria. La segunda o posteriores exposiciones al mismo antígeno se denomina inmunización secundaria y la respuesta generada, más intensa y duradera que la primera, es la respuesta secundaria (booster). Respuesta Primaria: La respuesta primaria de anticuerpos puede dividirse en 4 fases: 1- Fase de latencia: es el tiempo que transcurre entre la exposición al antígeno y la detección de anticuerpos en el suero. Dura de 5 a 10 días. Es el tiempo que transcurre desde la entrada del antígeno vaccinal hasta la activación de los linfocitos T y B, es decir en tomar o con el antígeno, proliferar y diferenciarse.

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ 2- Fase exponencial: se produce un importante incremento de la concentración de anticuerpos en el suero, reflejando un incremento en el número de células plasmáticas productoras de anticuerpos. 3- Fase de estabilidad: el título de anticuerpos permanece estacionario (equilibrio entre la producción y degradación de anticuerpos) 4- Fase de declinación: la concentración de anticuerpos decrece como reflejo del declive de la respuesta inmune y la progresiva eliminación del antígeno.

RESPUESTA INMUNE PRIMARIA Y SECUNDARIA NIVEL DE Ag SERICOS

RESPUESTA SECUNDARIA

RESPUESTA PRIMARIA

Fase estabilidad Fase de declinación

Fase exponencial Fase latencia 0

7

PRIMER O CON EL ANTIGENO

14

21

DIAS

SEGUNDO O CON EL ANTIGENO

Respuesta secundaria: La reexposición al mismo antígeno vaccinal al cabo de un tiempo induce una respuesta inmune secundaria mucha más intensa y duradera que la primaria. La fase de latencia es más corta, el incremento de títulos de anticuerpos más rápido y los niveles alcazados más elevados, continuando la producción durante un largo período incluso años. La mayoría de los anticuerpos producidos son de tipo IgG. Lo que distingue la respuesta inmune primaria de la secundaria es la memoria inmunológica generada durante la respuesta primaria, la cual es específica y de larga duración. Bases inmunológicas de las vacunas - Dr. Miguel F. Galicchio

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ El objetivo de los programas de vacunación es el establecimiento de esta memoria para la generación de respuestas secundarias específicas intensas y duraderas, que eviten la infección clínica en caso de un nuevo o con el agente infeccioso. La respuesta secundaria puede incrementarse en las inmunizaciones sucesivas hasta que se alcance el límite fisiológico máximo de respuesta. Todos los inmunógenos vaccinales pueden inducir respuesta primaria, pero sólo los antígenos T- dependientes (proteicos) son capaces de una respuesta inmune secundaria. Los antígenos T- independientes (polisacáridos capsulares) no inducen memoria inmunológica, lo que hace que la respuesta secundaria tenga las mismas características que la primaria.

ANTICUERPOS IgM e IgG EN RESPUESTAS INMUNES PRIMARIAS Y SECUNDARIAS TITULO DE ANTICUERPOS

RESPUESTA SECUNDARIA

RESPUESTA PRIMARIA

IgM

0

IgG

7

14

EXPOSICION PRIMARIA

21

28

35

42

DIAS

EXPOSICION SECUNDARIA

Parámetro

Respuesta primaria

Respuesta secundaria

Linf. B que responden

Linf B vírgenes

Linf B memoria

Cel presentadora de Ag

Macrófagos

Linf B memoria

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ Latencia

5 – 10 días

1 – 3 días

Pico título anticuerpos

Bajo

Alto

Persistencia del título

Corta

Larga

Tipos de anticuerpos

IgM > IgG

IgG o IgA (Sabin)

Afinidad Ac por Ag

Baja

Elevada

Inducción

Todos los antígenos

Sólo T- dependientes

Dosis de Ag para Elevada generar respuesta

Baja

Ac: anticuerpos Ag: antígenos Linf B: linfocitos B

Requisitos de una vacuna: El conocimiento de la respuesta inmunológica a los diferentes agentes infecciosos permite enunciar 4 requisitos generales para la elaboración de una vacuna. Estos se cumplen totalmente en las inmunizaciones a virus vivos atenuados: 1- Activación de las células presentadoras de antígenos para iniciar el procesamiento antigénico. 2- Activación de linfocitos T y B con la formación de gran cantidad de células de memoria. 3- Reconocimiento por los linfocitos T de múltiples epitopes. 4- Persistencia de los antígenos en los tejidos linfoides donde los linfocitos B de memoria continúan produciendo anticuerpos a lo largo del tiempo. Las combinaciones de antígenos en vacunas múltiples inducen una respuesta adecuada para cada uno de ellos y facilitan los esquemas inmunitarios (recordar que hasta el momento hay una excepción con las vacunas combinadas de hepatitis B en la cual cuando la usamos en esta forma siempre tenemos que cubrir hepatitis B con 4 dosis). Las vacunas con virus atenuados parenterales estimulan la producción de interferones que pueden inhibir la efectividad antigénica de otra inmunización de iguales características. Esta dificultad se resuelve con la istración simultánea de las mismas o espaciándolas por lo menos 4 semanas (ej: triple viral, varicela).

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ANAFILAXIA Definición: es una respuesta clínica a una reacción inmunológica inmediata entre un antígeno y un anticuerpo (tipo IgE) dando lugar a la liberación de mediadores, afectando órganos y sistemas y presentando signos y síntomas de variable intensidad. Características: • En niños su presentación es infrecuente (menos de 1 caso cada 200.000 inmunizaciones) • La intensidad del proceso suele relacionarse con la rapidez de la instauración de los síntomas (entre escasos minutos y dos horas). • Se presenta con una amplia combinación de signos y síntomas. • La recurrencia no es infrecuente pudiendo ocurrir en un período de 2 a 48 horas. Aspectos clínicos de la Anafilaxia Aparatos y Sistemas Piel y mucosas Aparato respiratorio

Aparato cardiovascular Aparato gastrointestinal Aparato genitourinario Sist. Nervioso

Signos y síntomas Eritema- urticaria- prurito nasalEdema periorbitario- angioedema- rubefacción- palidez- cianosis a) vías aéreas superiores: estornudos- rinorrea- ronquera- edema glosofaríngeo- estridor b) vías aéreas inferiores: disnea- broncoespasmo- sibilancias- apnea- asfixia Taquicardia- arritmia- hipotensión- paro Disfagia- náuseas- vómitos- cólicos intestinales- diarrea- incontinencia Cólicos uterinos- incontinencia urinaria Ansiedad- convulsiones- pérdida de la conciencia

Para el diagnóstico diferencial la relacionaremos con la reacción vagal o la lipotimia. Mientras que estas 2 entidades se presenta la palidez y pérdida de conciencia en forma brusca, en la anafilaxia son más frecuentes las manifestaciones de las vías aéreas superiores y cutáneo- mucosas.

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Actitud y tratamiento de la Anafilaxia

VALORACIÓN

MANIFESTACIONES

CUTÁNEO- MUCOSAS

VÍAS AÉREAS SUPERIORES E INFERIORES

NEUROLÓGICAS

CARDIOLÓGICAS

RIESGO VITAL

SI

NO

TR AT AMIEN TO ANAFILÁCTICO

1. 2.

Posición de Trendelemburg Medicación 1º elección adrenalina

3. 4. 5.

asociar antihistamínicos y corticoides Vía p arenteral Medicación sintomática Traslado a centro de mayor complejidad

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CURSO A DISTANCIA “ACTUALIZACIÓN EN INMUNIZACIONES 2010” HOSPITAL DE NIÑOS DR. RICARDO GUTIERREZ MEDICACION DE ANAFILAXIA Principio

Dosis

Lugar anatómico

Máximo

Repetición

0,01 ml / kg ( 1 decima cada 10 kg)

IM (1º elección)/ SC

0,3-0,5 ml

Cada 15-20 minutos Máximo 3 dosis

oxigeno Adrenalina 1/1000 1 ml =1mg Ampolla de 5 ml

Antihistaminicos Difenhidramina

Inicial: 1-2 IM/ / EV / mg/kg/dosis SC / VO Mantenimie nto 2 -5 mg/kg/24 horas

Hidrocortisona

Inicial 4-10 mg /kg/dosis Mantenimie nto 5 mg/ kg/24 hs metilprednisolona cada 6 hs EV

EV

Ataque 100mg Mantenimiento 300mg/24 hs VO

250 mg/dosis EV

EV / IM

Inicial 1-2 mg/kg/dosis Mantenimie nto 2 mg /kg/dosis

¿QUE HACER FRENTE A PACIENTES QUE HAN PRESENTADO REACCIÓN ANAFILACTICA PREVIA ANTE LA APLICACIÓN DE UNA NUEVA VACUNA?

•

Sería deseable que en aquellos pacientes con alergia alimentaria confirmada (huevo, leche) que se relacionan con el contenido de algunas vacunas, portarán un informe escrito por el especialista para poder ser premedicados previo a la aplicación del antígeno vaccinal.

Premedicación a istrar en estos pacientes: (24 a 48 hs previo al acto vacunal) - Difenhidramina 2 a 5 mg/kg/día - Prednisona 1 mg/kg/día • Dejar al paciente en control por el término mínimo de 4 horas •

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Realizar el procedimiento en un lugar que cuente con servicio de cuidados intensivos pediátricos En caso de reacción anafiláctica moderada a severa y severa internar al paciente por 24 hs por probable reacción tardía y medicar al alta con antihistamínicos y corticoides por 72 hs. Consultar con el especialista.

Bibliografía: 1) Ada G. Vaccines and vaccination. The New England Journal of Medicine, 2001;345 nº 14: 1042-53. 2) Salleras San Martí L y otros. Vacunaciones preventivas: principios y aplicaciones. 2003, 37-55. 3) Reed Book. Enfermedades Infecciosas en Pediatria. Seguridad y Contraindicaciones en Vacunas. 2009 4) Plotkin S., Orenstein W. Fourd edition, WB Sanders Co., Philadelphia, 2005. 5) Fainboim L, Satz I, Geffner J. Introducción a la Inmunología Humana. 4ª ed. Buenos Aires: 1999: caps. 2, 3, 4 y 5. 6) Stiehm R, Kline M, Shearer W. Active and ive immunization in the prevention of infectious diseases. En: Immunologic disorders in infants and children. 5th ed. New York: Saunders Company, 2004: 916-955. 7) Lieberman PL. Anaphylaxis and anaphylactoid reactions. Middleton's Allergy: Principles and Practice, 6th edition. Mosby, 2003. 8) Drain K y Volcheck G. Preventing and Managing Drug-Induced Anaphylaxis. Drug Safety 24(11):843-853, 2001. 9) Practice Parameters for Diagnosis and Management of Anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol 1998;101 (June)): S465-S528.

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